Jessay

(8) Ferrous ion chelating 효과 측정

 Ferrous ion chelating 효과 측정은

Marcocci L 등(1994)의 방법으로 측정하였다.

시료용액 1 mL (0.1 mg/mL, 0.5 mg/mL 및 1.0 mg/mL),

80% ethanol 0.8 ml,

2 mM FeCl2⦁4H2O [iron(II) chloride tetrahydrate; 220299, Sigma, St. Louis, MO, USA]

용액 0.1 mL를 넣은 후

30분간 실온에서 반응시킨 후,

5 mM ferrozine [3-(2-pyridyl)-5, 6-diphenyl-1, 2, 4-triazine-4', 4''-disulfonic acid; P5338, Sigma]

용액 0.1 mL를 첨가한 다음 혼합하여

실온에서 10분간 반응시켰으며,

562 nm에서 흡광도를 측정하였다.

추출물의 chelating 효과는

아래의 수식에 따라 산출한 후,

대조구로는 대표적인 chelating agent인

EDTA(0.1 mg/mL)를 사용하였다.

Chelating activity (%) = ( 1-A / B ) × 100

 A: 시료 첨가군의 흡광도

 B: 용매 첨가군의 흡광도

(9) 통계 처리

 실험결과는 SAS package(release 8.01)를 이용하여

평균±표준편차로 표시하였고,

평균값의 통계적 유의성은

p<0.05 수준에서

Duncan's multiple range test(SAS 1990)에 의해

검정하였다.

(6) 아질산염 소거능 측정

 아질산염(NaNO2) 소거능은

Gray JI & Dugan LR(1975)의 방법으로 측정하였다.

즉, 1 mM NaNO2 용액 2 mL에

시료용액(1 mg/mL) 1 mL를 가하고

0.1 N HCl(pH 1.2), 0.2 M 구연산완충액(pH 3.0 및 pH 6.0)으로

각각 pH 1.2, 3.0 및 6.0으로 조정한 후

반응액을 10 mL로 하였다.

이 용액을 37℃에서 1시간 반응시킨 후

각 반응액을 1 mL씩 취하여

2% 초산용액 5 mL와 Griess 시약

(30% 초산용액에 1% sulfanilic acid 와 1% naphthylamine을 1:1 비율로 혼합한 것)

0.4 mL을 가하여 잘 혼합하였다

이 혼합액을 15분간 실온에서 방치한 후

520 nm에서 흡광도를 3반복 측정하여

아질산량을 구하였다.

 대조구는 Griess시약 대신

증류수를 0.4 mL 가하여 동일하게 행하였다

 아질산염 소거작용은

시료를 첨가한 경우와

무첨가한 경우의 아질산염 백분율로 나타내었다. 

               N : 아질산염 소거능

               A : 1 mM NaNO2 용액에 시료를 첨가하여

                   1시간 반응후의 흡광도                        

               B : 1 mM NaNO2 용액에 시료 대신에 증류수를

                   첨가하여 1시간 반응후의 흡광도  

               C : 시료 추출물 자체의 흡광도

(7) SOD(supeoxide dismutase) 유사활성능 측정

 SOD 유사활성능은

Marklund S & Marklund G(1974)의 방법을

 변형하여 측정하였다.

즉, 일정농도의 시료용액

(0.5 mg/mL, 1.0 mg/mL 및 2.0 mg/mL) 0.4 mL에

pH 8.5로 보정한

tris-HCl buffer(50 mM tris + 10 mM EDTA) 5.2 mL와

7.2 mM pyrogallol(containing 10 mM HCl) 0.4 mL 가하고

실온에서 10분간 방치한 후,

1 N HCl 용액 0.2 mL를 첨가하여 반응을 정지시킨 후,

여과지(Whatman No. 1)로 여과하여

420 nm에서 흡광도를 측정하였다.

이때 superoxide dismutase 유사활성능은

아래의 식으로부터 구하였다.

           A : 시료첨가구의 흡광도   

           B : 시료 무첨가구의 흡광도

           단, A, B는 대조구의 흡광도를 제외한 수치임

(3) 총 페놀 화합물 함량 측정

 총 페놀화합물 함량(Kim DO 등 2003)은

Folin-Ciocalteu’s phenol reagent가

추출물의 폴리페놀성 화합물에 의해 환원된 결

 몰리브덴 청색으로 발색하는 것을 원리로 분석하였다.

400 μl 추출액에

2%  sodium carbonate 용액 4ml를 가하고

정확히 3분 후에 Folin Ciocalteu’s phenol reagent 를

200 μl를 가하고 60분 방치한 후

750 nm에서 반응액의 흡광도 값을 측정하였고

표준물질로 tannic acid를 사용하여

표준 검량선을 작성하였으며,

표준곡선 작성에 이용한 tannic acid의 농도는

25, 50, 100 μg/ml이었다.

총 폴리페놀 함량은

시료 g중의 mg tannic acid로 나타내었다.

(4) 총 플라보노이드 함량 측정

 총 플라보노이드 함량(Kang YH 등 1996)은

시료용액(200 μg/mL) 1 mL와

diethylene glycol 10 mL를 혼합하고

 여기에 1 N NaOH용액 1 mL 가하여

잘 혼합한 후 37℃에서 1시간 반응시킨 후

 420 nm에서 흡광도를 측정하였다.

이때 표준검량곡선은

quercetin(Sigma Co., St. Louis, USA)을 사용하여 작성하였으며,

표준곡선 작성에 이용한 quercetin의 농도는

50, 100, 150 및 200 μg/mL이었다. 

 플라보노이드 함량은

시료 g중의 mg quercetin으로 나타내었다. 

(5) DPPH에 의한 전자공여능 측정

 시료 추출물들에 대한 비효소계 시스템에서의

radical 소거능을 측정하고자

DPPH에 의한 전자공여능(electron donating ability)을 검색하였다.

전자공여능은 Blois방법(Blois MS 1958)을 응용하여

DPPH(1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl)에 대한

각 시료들을 3반복하여 전자공여능으로 측정하였다.

즉, 일정농도의 시료용액

(0.1 mg/mL, 0.15 mg/mL 및 0.2 mg/mL) 1 mL를

각각 취하여 0.1 mM DPPH 용액(absolute ethanol solution)

4 mL과 잘 혼합하여 실온에서 30분간 반응시킨 후

517 nm에서 흡광도를 3반복하여 측정하였으며

 따로 무첨가구 시험을 하여

대조구의 흡광도를 같은 조건에서 측정하였다.

비교구로 ascorbic acid와 BHT를 이용하여

위와 동일한 방법으로 전자공여능을 측정하여

시료군과 비교하였다.

이들 측정값을

다음과 같은 계산식에 의해

DPPH 전자공여능을 계산하였다.

단순회귀분석을 통하여

시료 무첨가구의 전자공여능을 50% 감소시키는데

필요한 시료의 농도(mg/mL)를 IC50값으로 나타냈다.

               A : 시료 첨가구의 흡광도

               B : 시료 무첨가구의 흡광도

자생 엉겅퀴 잎 추출물의

항산화효과 및 생리활성

Antioxidative and Physiological Activities of

Cirsium Japonicum var. ussuriense Leaf

Extract

실험 목차

<재료 및 방법>

 1. 실험재료

 2. 실험 방법

  (1) 일반성분 분석

  (2) 메탄올 추출물의 제조

  (3) 총페놀화합물 함량 측정

  (4) 총플라보노이드 함량 측정

  (5) DPPH에 의한 전자공여능 측정

  (6) 아질산염 소거능 측정

  (7) SOD(superoxide dismutase) 유사활성능 측정

  (8) Ferrous ion chelating 효과 측정

  (9) 통계처리

<결과 및 고찰>

    1. 일반성분

    2. 추출 수율

    3. 총페놀화합물&총플라보노이드 함량

    4. DPPH에 의한 전자공여능

    5. 아질산염 소거능

    6. SOD(superoxide dismutase) 유사활성능

    7. Ferrous ion chelating 효과 측정

<요약 및 결론>

<참고문헌>

1. 실험재료

본 실험에서 일반성분 분석 및

생리적 활성을 측정을 위해

사용된 엉겅퀴(Cirsium japonicum var. ussuriense)는

강원도 정선에서 채취하였고,

잎 부분만을 따로 분리하여 분쇄하여

40mesh에 통과시킨 후

-40℃에서 냉동 보관하면서 시료로 사용하였다.

2. 실험방법

1) 일반성분 분석

일반성분은 AOAC법(A.O.A.C. 1995)에 따라 행하였다

즉, 수분은 105℃ 상압건조법,

조지방은 Soxhlet 추출법,

조단백은 semi micro Kjeldahl법(N x 6.25),

조회분은 550℃ 회화법

탄수화물은 100에서 수분, 조지방, 조단백, 조회분을

뺀 값으로 하였다. 

3) 메탄올 추출물 제조

엉겅퀴(Cirsium japonicum var. ussuriense)를

99.5% 메탄올을 사용하여 추출한 방법은 다음과 같다

 즉, 엉겅퀴(Cirsium japonicum var. ussuriense)를

먼저 분쇄기(IKA M20, IKA, Germany)로 40 mesh로 조분쇄한 후

methanol을 가하여 3시간 침지, 여과하여 추출하였다.

추출물은 여과지(Whatman No. 2)로 여과하고

남은 잔사에 다시 용매를 가하여

위와 동일한 방법으로 3반복 추출하여 제조하였다.

이 추출물을 40±1oC에서

감압농축(rotary evaporator N-1000, EYELA, Japan)하여

80℃의 상압건조기(Dry oven HST-502M, Hanbaekst, Korea)에서

용매를 완전히 제거하였다.

추출 수율의 측정은 추출에 사용한 시료의 건물에 대한

추출물의 총 고형분 함량의 백분비로 하였다.

제조된 메탄올 추출물 시료는

냉동실(-40℃)에서 보관하면서 실험에 사용하였다. 

엉겅퀴속(Cirsium Miller)은

국화과(Asteraccac)의 국화아과(Asyeroideae)

엉겅퀴족(Cynareae) 엉겅퀴아족(Carduinae)에

속하는 식물군으로 전 세계적으로 250~300여 종이

한국, 중국, 일본, 만주, 러시아 그리고 대만 등의

북반구 온대지역을 비롯하여

북미, 유럽, 북아프리카 등에 분포한다

* 참고문헌

Song MJ 등 2007, Kim EM 등 2009

엉겅퀴(Cirsium japonicum var. ussuriense)는

2년 초로 연한 줄기는 껍질을 벗겨서 생으로 먹거나 나물로 먹으며,

큰 엉겅퀴(Cirsium pendulum Fischer)는 다년초로

어린 순은 나물로 먹는다.

고려엉겅퀴(Cirsium setidens Nakai)는 ‘곤드레’라고도 하며,

다년초로 산과 들판에 약간 그늘진 곳에 자라고

4~5월경 어린 순을 나물, 국, 볶음 등으로 먹는

우리나라 특산물의 하나이다

* 참고문헌

Lee YM 등 2008, Lim SS 등 1997a, Suh JT 등 1995

국내외 엉겅퀴 연구를 보면,

엉겅퀴속 식물은 생리활성이 뛰어난

apienin, luteolin, myricetin,  kaemferol, pectolinarin,

5,7-dihydroxy- 6,4'-dimethoxyflavone,

hispidulin-7-neo-hesperioside를 포함한

약 78종의 falvonoid가 확인되었으며,

apigenin은 암예방 효과 및 신경보호 효과,

항염증, 항진경 및 항균작용 등의

생리 활성이 있다고 보고하고 있다

*참고문헌

Chung MS 등 2007, Liu S 등 2006, Lee HK 등 2003,

Lee MK 등 2002, Lim SS 등 1997b

또한 엉겅퀴는 지질과산화를 억제하고

glutathione reductase의 활성을 증가시켜

알코올 해독을 촉진시키므로 간 보호 작용이 있으며

*참고문헌

Park JC 등 2004

ICR 쥐에게 300mg/kg 투여 시 항우울 작용이 있음을 확인하였다

*참고문헌

Park HK 등 2006

고지혈증 시 혈청 지질 함량을 감소시키고,

간장 내 총 콜레스테롤, 중성지질 등의 농도를

감소시키므로 간 손상을 지연시킬 수 있다

*참고문헌

Lim SS 등 1997, Lim SS 등 1997a

엉겅퀴 꽃 추출물에서 apigenin, luteolin이 검출되었으며

*참고문헌

Kim SJ 2003

엉겅퀴 잎 추출물은

항류마티스성의 효과가 있다고 하였다

* 참고문헌

Lee JH 등 2008

따라서 본 연구에서는

국내에 자생하는 엉겅퀴를 채취하고

잎을 메탄올로 추출하여

생리활성 및 항산화 활성을 연구하고

엉겅퀴를 이용한

천연항산화제 개발 및 건강기능식품의 개발을 위한

기초자료로 사용하고자 한다.

자생 엉겅퀴 잎 추출물의

항산화효과 및 생리활성

Antioxidative and Physiological Activities of

Cirsium Japonicum var. ussuriense Leaf

Extract

대부분의 호기성 생물체는

산소를 이용하여 에너지 대사를 하며

대사과정에서 발생하는

활성산소의 상해에 대해

여러 자기방어 기구를 구비하고 있다.

그러나 조직의 방어능을 초과하는

활성산소의 생성은

성인병이라 불리어지는

관절염, 순환기장애 뿐만 아니라

치매 등과 같은 여러 질환읜 원인이 되고 있다.

*참고문헌

Halliwell B 1991, Fukuzawa K 등 1990

유해산소라고도 불리는 활성산소는

가장 안정한 형태의 산소인

삼중항 산소 (³O₂)가 산화-환원과정에서

환원되어 생성되는 일중항산소인

superoxide anion 라디칼(·O₂­­-)이나

과산화수소(H₂O₂) 및

hydroxyl 라디칼(·OH)처럼 짝짓지 않은

상태의 전자를 갖는

프리 라디칼(free radical)들로서,

이들은 단백질, DNA, 효소 및 T세포와 같은

면역체계에 관여하는 세포 혹은 인자들을

손상시켜 여러 가지 질환을 일으킨다

*참고문헌

Regnstrom J 등 1922, Gey K 등 1911, Abuja PM 등 2001,

Kroemer G 등 1955, Marnett LJ 2000, Rice-Evans CA 등 1993,

Shigenaga MK 등 1994, Ames BN 1989, Esterbauer H 등 1990,

Dizdaroglu M 등 1990, Fedtke N 등 1990, Johnson TM 등 1996

때문에 활성산소를 효과적으로 제거하는

항산화제의 개발 연구가 진행되어

superoxide dismutase(SOD),

catalase, glutathione peroxidase 등과 같은 항산화효소와

vitamin E, vitamin C, carotenoid, glutathione,

β-carotene, astaxanthin 및  합성 항산화제인 t-Butyl-4-hydroxyani

sole(BHA),  3,5-(t-Butyl)-4-hydroxy toluene(BHT) 등

여러 가지 항산화제가 알려졌으나,

항산화 효소는 단백질로 구성되어

온도나 pH에 심한 영향을 받아 산업적으로 응용하기 어렵고

 합성 항산화제 경우에는 변이원성 및 독성이 지적되면서

보다 안정하면서 효능이 높은 천연 항산화제의 개발이

절실히 요구되고 있는 실정이다

*참고문헌

Kitahara K 등 1992, Hatano T 1995, Masaki H 등 1995,

Cort WM 1974, Branen AL 1975

대학시절 국내 엉겅퀴에 대한

항산화 실험을 통해

미래 항상화제 개발의 가능성을

확인하기 위한 실험을 진행했다.

국내 자생 엉겅퀴의

잎, 줄기, 뿌리 중에서

잎 부분의 항산화실험을 진행하였으며

여러 실험결과를 공유하려 한다.