Jessay

6. SOD(supeoxide dismutase) 유사활성능 측정

생체에서 과산화지질의 형성물질로는

superoxide radical,

H2O2, hydroxy radical(HO·),

singlet oxygen(1O2) 등을 들 수 있으며,

보통산소에 비해 대단히 반응성이

크기 때문에 매우 중요하다.

생체에서는

SOD(superoxide dismutase),

catalase,

glutathion peroxidase 등의

효소계 항산화제와

tocopherol,

ascorbic acid,

propyl gallate,

selenium과 같은

비효소계 항산화제에 의해 소거된다

* 참고문헌

Mc Cord JM & Fridovich I 1969, Yang CT 2010

SOD는 생체내 항산화효소의 일종으로

세포내 활성산소를 과산화수소로 전환하는 반응을

촉진하는 작용을 한다.

SOD에 의해 생체내에 생성된 H₂O₂는

catalase나 peroxidase에 의해

물과 산소로 전환된다

* 참고문헌

Kim TS 등 2007

이러한 SOD와 똑같지는 않지만

유사활성 측정방법이 실험실에서 사용되고 있는데

superoxide anion의 활성을 억제시키는 물질

즉, SOD 유사활성 측정방법이 널리 이용되고 있어

이를 이용해 자생 엉겅퀴 잎의 메탄올 추출물의

SOD 유사활성을 측정한 결과는 Fig. 5와 같았다.

Fig. 5에서 보는 바와 같이

자생 엉겅퀴 잎의 메탄올 추출물의

SOD 유사활성은 농도가 증가함에 따라

증가하는 경향을 보였다.

자생 엉겅퀴의 SOD 유사활성은

0.5 mg/mL에서 19.27%,

1.0 mg/mL에서 21.35%,

2.0 mg/mL에에서 25.00%를 나타내었다.

따라서 자생 엉겅퀴 잎의 메탄올 추출물에서도

 SOD 유사활성을 나타내는

생리활성 물질이 함유되어 있음을 알 수 있었다.

자생 엉겅퀴 잎의 메탄올 추출물의

SOD 유사활성은 농도가 증가함에 따라

증가하는 경향을 보였으나

농도의 증가정도에 비해서

SOD 유사활성의 증가정도는 적은 경향을 보였다.

Ascorbic acid의 경우

0.5 mg/mL의 농도에서도

BHT나 엉겅퀴 잎의 메탄올 추출물의

2 mg/mL의 농도보다도

훨씬 높은 SOD 유사활성능을 보였다.

Fig. 5. SOD-like activities of methanol extract of Cirsium japonicum var. ussuriense leaf.

a-iMeans with the different letters in the bars between samples are significantly different

   (p<0.05) by Duncan's multiple test. Values are mean±SD(n=3).

7. Ferrous ion chelating 효과 측정

Fe2+은 체내에서

세포의 지질 및 단백질의 산화를 촉진한다.

Fe2+의 chelating 효과를 측정하기 위해

자생 엉겅퀴 잎의 메탄올 추출물로 측정결과,

Fig. 6과 같았다.

Ferrozine은 Fe2+와 complex를 형성하여

붉은색을 띠게 되는데

이 때 시료 중에

킬레이트 효과를 가진 물질이 존재하면

Fe2+-ferrozine complex 형성을 방해하여

발색이 저해된다

* 참고문헌

Kim EM & Won SI 2009

Fig. 5에서 보는 바와 같이,

자생 엉겅퀴 잎의 메탄올 추출물의

ferrous ion chelating 효과는

0.5 mg/mL에서 23.05%,

1 mg/mL에서 44.77%,

2 mg/mL에서 84.34%의 효과를 나타내었다.

Fig. 5에서 보는 바와 같이

자생 엉겅퀴 잎의 메탄올 추출물의

ferrous ion chelating 효과는 농도가 증가함에 따라

그 효과가 증가하였으며,

EDTA 0.05 mg/mL 농도에서의

ferrous ion chelating 효과보다는 모두 낮았다.

Fig. 6. Ferrous ion chelating effects of methanol extract of Cirsium japonicum var. ussuriense leaf.

a-bMeans with the different letters in the bars between samples are significantly different

    (p<0.05) by Duncan's multiple test. Values are mean±SD(n=3).

4. DPPH에 의한 전자공여능 측정

 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)는

화합물 내 질소 중심의 안정화된 구조의

radical로 존재하지만,

반응계에서 전자를 공여하면

고유의 청남색이 엷어지는 특성이 있기 때문에

이 흡광도의 감소비율을

517 nm에서 비색 정량하여

시료의 전자공여능(electron donating ability, EDA)을

측정할 수 있다.

따라서 전자공여능은

free radical에 전자를 공여하여

식품 중의 지질산화를

억제하는 척도로 널리 사용되고 있다

*참고문헌

Shin JH 등 2005

자생 엉겅퀴 잎의 메탄올 추출물의

DPPH에 의한 전자공여능 측정결과는

Fig. 3와 같았다. 

Fig. 3에서 보는 바와 같이

자생 엉겅퀴 잎의 메탄올 추출물의

DPPH에 의한 전자공여능(0.2 mg/mL)을

측정한 결과, 72.84% 이었고,

IC50은 0.11 mg/mL이었다.

자생 엉겅퀴 잎의 메탄올 추출물은

BHT와 ascorbic acid의 전자공여능과 비교해 볼 때,

각각의 농도에서 모두 BHT보다 높았으며,

ascorbic acid보다는 모두 낮은 것으로 나타났다.

              Fig. 3. Electron donating abilities of methanol extract of Cirsium japonicum var. ussuriense leaf.

               a-gMeans with the different letters in the bars between samples are significantly different

                  (p<0.05) by Duncan's multiple test. Values are mean±SD(n=3).

5. 아질산염 소거능 측정

 아질산염은 제2급, 제3급 아민과의

nitroso화 반응이 일어나서

발암물질인 nitrosamine을 생성할 수 있다.

또 질산염은 그 자체는 독성이 없으나

타액이나 위내에서 질산환원 효소나 환원세균에 의해

아질산염으로 환원되어

아질산염과 같은 독성을 나타낸다

* 참고문헌

Peter FS 1975, Fiddler W 등 1973

자생 엉겅퀴 잎의 메탄올 추출물의

아질산염 소거능을 측정한 결과는

Fig. 4와 같았다.

Fig. 4에서 보는 바와 같이,

자생 엉겅퀴 잎의 메탄올 추출물의

아질산염 소거능을 측정한 결과,

pH 6.0에서 8.35%,

pH 3.0에서 28.29%,

pH 1.2에서 56.38%로,

pH가 낮아짐에 따라

아질산염 소거능이 높아지는 경향을 보였으며

각각의 pH에서 BHT보다는

아질산염 소거능이 낮았지만

BHT와 비슷한 아질산염 소거능을 나타내었다.

Kim HK 등(2002)은 팽이버섯 추출물의

기능적 특성 연구에서

팽이버섯 추출물에 함유된

폴리페놀성 물질들의 아질산염 소거능은

pH 3.0∼6.0 보다 pH 1.2에서

비교적 높은 수치를 보였으며

이는 위장내의 낮은 pH 조건에서

니트로사민 형성을 보다 효과적으로

억제할 수 있다고 보고하였다.

즉, pH 1.2 조건에서

자생 엉겅퀴 잎의 메탄올 추출물은

위장내에서의 니트로사민 형성을

효과적으로 억제할 수 있을 것으로 기대되었다.

Fig. 4. Nitrite-scavenging abilities of methanol extract of Cirsium japonicum var. ussuriense leaf.

a-bMeans with the different letters in the bars between samples are significantly different

   (p<0.05) by Duncan's multiple test. Values are mean±SD(n=3).

(6) 아질산염 소거능 측정

 아질산염(NaNO2) 소거능은

Gray JI & Dugan LR(1975)의 방법으로 측정하였다.

즉, 1 mM NaNO2 용액 2 mL에

시료용액(1 mg/mL) 1 mL를 가하고

0.1 N HCl(pH 1.2), 0.2 M 구연산완충액(pH 3.0 및 pH 6.0)으로

각각 pH 1.2, 3.0 및 6.0으로 조정한 후

반응액을 10 mL로 하였다.

이 용액을 37℃에서 1시간 반응시킨 후

각 반응액을 1 mL씩 취하여

2% 초산용액 5 mL와 Griess 시약

(30% 초산용액에 1% sulfanilic acid 와 1% naphthylamine을 1:1 비율로 혼합한 것)

0.4 mL을 가하여 잘 혼합하였다

이 혼합액을 15분간 실온에서 방치한 후

520 nm에서 흡광도를 3반복 측정하여

아질산량을 구하였다.

 대조구는 Griess시약 대신

증류수를 0.4 mL 가하여 동일하게 행하였다

 아질산염 소거작용은

시료를 첨가한 경우와

무첨가한 경우의 아질산염 백분율로 나타내었다. 

               N : 아질산염 소거능

               A : 1 mM NaNO2 용액에 시료를 첨가하여

                   1시간 반응후의 흡광도                        

               B : 1 mM NaNO2 용액에 시료 대신에 증류수를

                   첨가하여 1시간 반응후의 흡광도  

               C : 시료 추출물 자체의 흡광도

(7) SOD(supeoxide dismutase) 유사활성능 측정

 SOD 유사활성능은

Marklund S & Marklund G(1974)의 방법을

 변형하여 측정하였다.

즉, 일정농도의 시료용액

(0.5 mg/mL, 1.0 mg/mL 및 2.0 mg/mL) 0.4 mL에

pH 8.5로 보정한

tris-HCl buffer(50 mM tris + 10 mM EDTA) 5.2 mL와

7.2 mM pyrogallol(containing 10 mM HCl) 0.4 mL 가하고

실온에서 10분간 방치한 후,

1 N HCl 용액 0.2 mL를 첨가하여 반응을 정지시킨 후,

여과지(Whatman No. 1)로 여과하여

420 nm에서 흡광도를 측정하였다.

이때 superoxide dismutase 유사활성능은

아래의 식으로부터 구하였다.

           A : 시료첨가구의 흡광도   

           B : 시료 무첨가구의 흡광도

           단, A, B는 대조구의 흡광도를 제외한 수치임

(3) 총 페놀 화합물 함량 측정

 총 페놀화합물 함량(Kim DO 등 2003)은

Folin-Ciocalteu’s phenol reagent가

추출물의 폴리페놀성 화합물에 의해 환원된 결

 몰리브덴 청색으로 발색하는 것을 원리로 분석하였다.

400 μl 추출액에

2%  sodium carbonate 용액 4ml를 가하고

정확히 3분 후에 Folin Ciocalteu’s phenol reagent 를

200 μl를 가하고 60분 방치한 후

750 nm에서 반응액의 흡광도 값을 측정하였고

표준물질로 tannic acid를 사용하여

표준 검량선을 작성하였으며,

표준곡선 작성에 이용한 tannic acid의 농도는

25, 50, 100 μg/ml이었다.

총 폴리페놀 함량은

시료 g중의 mg tannic acid로 나타내었다.

(4) 총 플라보노이드 함량 측정

 총 플라보노이드 함량(Kang YH 등 1996)은

시료용액(200 μg/mL) 1 mL와

diethylene glycol 10 mL를 혼합하고

 여기에 1 N NaOH용액 1 mL 가하여

잘 혼합한 후 37℃에서 1시간 반응시킨 후

 420 nm에서 흡광도를 측정하였다.

이때 표준검량곡선은

quercetin(Sigma Co., St. Louis, USA)을 사용하여 작성하였으며,

표준곡선 작성에 이용한 quercetin의 농도는

50, 100, 150 및 200 μg/mL이었다. 

 플라보노이드 함량은

시료 g중의 mg quercetin으로 나타내었다. 

(5) DPPH에 의한 전자공여능 측정

 시료 추출물들에 대한 비효소계 시스템에서의

radical 소거능을 측정하고자

DPPH에 의한 전자공여능(electron donating ability)을 검색하였다.

전자공여능은 Blois방법(Blois MS 1958)을 응용하여

DPPH(1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl)에 대한

각 시료들을 3반복하여 전자공여능으로 측정하였다.

즉, 일정농도의 시료용액

(0.1 mg/mL, 0.15 mg/mL 및 0.2 mg/mL) 1 mL를

각각 취하여 0.1 mM DPPH 용액(absolute ethanol solution)

4 mL과 잘 혼합하여 실온에서 30분간 반응시킨 후

517 nm에서 흡광도를 3반복하여 측정하였으며

 따로 무첨가구 시험을 하여

대조구의 흡광도를 같은 조건에서 측정하였다.

비교구로 ascorbic acid와 BHT를 이용하여

위와 동일한 방법으로 전자공여능을 측정하여

시료군과 비교하였다.

이들 측정값을

다음과 같은 계산식에 의해

DPPH 전자공여능을 계산하였다.

단순회귀분석을 통하여

시료 무첨가구의 전자공여능을 50% 감소시키는데

필요한 시료의 농도(mg/mL)를 IC50값으로 나타냈다.

               A : 시료 첨가구의 흡광도

               B : 시료 무첨가구의 흡광도